Extracción y Purificación de enzimas

En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificación.

EXTRACCION DE ENZIMAS

Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solución son a menudo críticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las células, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras moléculas. A veces es necesario pasarlas a solución como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificación.

Aunque la dispersión de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecánicos, en muchos complejos enzimáticos están involucradas fuerzas específicas; de la naturaleza de las mismas depende el método a emplear.

En general, el primer paso consiste en la obtención de un homogenato, que implica la destrucción de la célula y el pasaje de las enzimas a solución o suspensión. Esto puede llevarse a cabo por:

a) Homogenización mecánica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como alúmina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotónico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertónico, en un buffer adecuado para controlar el pH.

b) Homogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, riñón, eritrocitos).

c) Desintegración t­érmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido.

d) Desintegración química: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, éter de petróleo, isopentanol, etc.

e) Homogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de proteínas por solventes orgánicos. En la preparación del "polvo acetónico" se utiliza acetona en frío.

PURIFICACION

Los métodos a elegir dependen de la fuente biológica y de la concentración de la enzima, y se basan en las distintas propiedades fisicoquímicas de las proteínas.

El primer paso consiste en la separación de los distintos componentes intracelulares, generalmente por centrifugación. Las partículas que difieren en densidad o tamaño sedimentan a distintas velocidades por aplicación de una fuerza centrífuga (campo gravitacional, g). Una centrifugación diferencial permite la separación del homogenato en varias fracciones. Un esquema tipo es el siguiente:

Cada una de las fracciones precipitadas puede tratarse con agentes químicos para solubilizar las enzimas que fuesen particuladas. A partir de aquí comienza la purificación.

Los procesos de purificación utilizan las técnicas clásicas de fraccionamiento proteico y pueden basarse en el movimiento de sustancias en una fase líquida (electroforesis o filtración en geles) o en la transición de sustancias de una fase a otra (cromatografía o precipitación). La elección de un determinado procedimiento es un problema de prueba y error: hay que probar procedimientos y seleccionar. En general, la repetición de un paso es ventajoso, ya sea en forma sucesiva o interpolando otros pasos, aunque a veces provoca grandes pérdidas de actividad total. Una vez llevado a cabo un paso satisfactorio, la cantidad de material resultante debe ser manejable antes de pasar al paso posterior.

Aparentemente los métodos pueden usarse en cualquier orden y el mejor orden se determina experimentalmente. Existen sin embargo ciertas restricciones que hacen que haya un orden lógico.

Por ejemplo, el calentamiento tiene por objeto eliminar grandes cantidades de proteínas inespecíficas y no requiere el agregado de grandes volúmenes de líquido; es lógico, por lo tanto, que se haga al principio. En muchos casos no es practicable por la inestabilidad de la enzima o por la presencia de enzimas proteolíticas que la dañarían mucho al elevar la temperatura, o bien porque no aumenta el grado de purificación.